Wie wird In-vitro-Fleisch hergestellt? - Teil 2
Zellkultur, Zelldifferenzierung und Gentechnik
8. November 2020
Die Nachfrage nach Fleischprodukten steigt sowohl in Ländern der Europäischen Union als auch global weiterhin an [1] - und dies trotz Lebensmittelskandalen, schlechten Haltungsbedingungen der Tiere und desaströsen Arbeitsbedingungen für die Angestellten der fleischverarbeitenden Industrie [2-4]. Jedes Jahr werden für unseren Fleischkonsum weltweit 80 Milliarden Tiere geschlachtet – zehn Tiere pro Mensch [5]. Auf der anderen Seite nehmen auch die Verkaufszahlen von Fleischersatzprodukten auf pflanzlicher Basis rasant zu und deren Umsatz übersteigt bei manchen Herstellern bereits den konventioneller Fleischprodukte [6-8].
Neben Fleischersatzprodukten auf pflanzlicher Basis stehen auch zellbasierte Fleischprodukte aus dem Labor oft im Fokus der Öffentlichkeit. An sogenanntes In-vitro-Fleisch sind viele Hoffnungen geknüpft: die Herstellung von In-vitro-Fleisch kommt ohne Massentierhaltung aus, benötige weniger Fläche und sei insgesamt umweltfreundlicher. Der Haken: noch gibt es kein fertiges In-vitro-Fleischprodukt im Supermarkt zu kaufen; die Akzeptanz bei Verbraucher*innen ebenso wie die letztendlichen Verminderungen von Umweltschäden gründen auf Vorhersagen und Modellrechnungen [9].
In-vitro-Fleisch basiert auf kultivierten, tierischen Zellen. In Teil 1 habe ich erklärt, wie wichtig das Zellkulturmedium als Nährstofflieferant für die Zellen ist. Es sollte auch klar geworden sein, dass das Medium genutzt werden kann, um das Wachstum und die Entwicklung von Zellen zu beeinflussen. Im zweiten Teil möchte ich nun näher auf die Zelltypen eingehen, die für die Herstellung von In-vitro-Fleisch genutzt werden bzw. genutzt werden können. In Teil 3 erkläre ich dann Mikroträger und Stützstrukturen und zeige verschiedene Ansätze für Bioreaktoren zur Erzeugung von In-vitro-Fleisch. Zum Schluss diskutiere ich mögliche Vorteile, die die Herstellung und ein vermehrter Konsum von In-vitro-Fleisch für Mensch und Umwelt mit sich bringen könnte.
Um In-vitro-Fleisch herzustellen werden Tierzellen in einer Zellkultur angezogen und aus den zunächst einzelnen Zellen dann ein fleisch-ähnliches Produkt erzeugt. Im August 2013 konnte auf diese Weise die erste zellbasierte Hamburger-Bulette unter der Leitung des niederländischen Forschers Mark Post hergestellt werden [10]. Die Herstellung nahm ganze zwei Jahre in Anspruch und verschlang 325.000 $. Inzwischen arbeiten weltweit mehr als 34 Unternehmen an der Herstellung von zellbasiertem Fleisch und haben sich das Ziel gesetzt, In-vitro-Fleischprodukte in einem Maßstab und zu Kosten anzubieten, die mit konventionellem Fleisch konkurrieren [11]. Doch welche Zellen werden eigentlich für In-vitro-Fleisch verwendet und woher stammen sie? Wie werden aus wenigen tierischen Körperzellen im Labor große Mengen an Muskelgewebe? Diese Fragen werde ich im folgenden Artikel beantworten.
Welche Zellen werden für In-vitro-Fleisch genutzt?
Stark vereinfacht ist In-vitro-Fleisch ein Muskel, der ohne die Beteiligung eines Tieres und dessen physiologische Prozesse gezüchtet wird. Im Gegensatz zu pflanzlichen Alternativen oder anderen Fleischalternativen [12] wird In-vitro-Fleisch aus Muskelzellen gewonnen und kommt somit der Skelettmuskulatur von Nutztieren sehr viel näher. Ausgangsmaterial für die Herstellung von zellbasiertem Fleisch sind Muskelstammzellen, sogenannte Satellitenzellen. Sie wurden im Jahr 1961 identifiziert und stellten sich als entscheidend für die Wiederherstellung des Muskels nach einer Verletzung heraus, da sie sich zu neuen Muskelfasern entwickeln können [13-15].
An dieser Stelle lohnt es sich, kurz auf den Aufbau eines Muskels einzugehen. Allgemein können drei verschiedene Arten von Muskelgewebe unterschieden werden: 1) glatte Muskulatur als Eingeweidemuskulatur (Muskeln innerer Hohlorgane); 2) Herzmuskulatur oder Myokard; 3) quergestreifte oder Skelettmuskulatur als Bestandteil des aktiven Bewegungsapparates. Die Mehrzahl von konventionellen Fleischprodukten basiert auf Skelettmuskulatur mit Fett- und Bindegewebe. Ein Skelettmuskel setzt sich wiederum aus mehreren Muskelfaserbündeln zusammen, die aus einzelnen Muskelzellen bestehen. Da Muskelzellen zum Teil bis zu 50 cm lang werden, bezeichnet man sie auch als Muskelfasern. In den Muskelfasern befinden sich tausende fadenförmige Strukturen, die sogenannten Myofibrillen, die als funktionelle Einheit mittels des Proteins Myosin und Filamenten aus Aktin für die Kontraktion der Muskelzelle sorgen.
Aufbau eines Skelettmuskels
Ein Video zum Aufbau eines Muskels (von User "Famulus", hochgeladen am 01.01.2017).
Die meisten für die Ernährung des Menschen genutzten Fleischprodukte basieren auf Skelettmuskeln. Ein Skelettmuskel besteht aus mehreren Muskelfaserbündeln, die sich wiederum aus einzelnen Muskelfasern zusammensetzen. Jede Muskelfaser ist selbst aus tausenden, fadenförmigen Strukturen aufgebaut, die Myofribrillen genannt werden. Myofibrillen durchziehen nebeneinander die Muskelfaser der Länge nach und bestehen aus den für die Kontraktion zuständigen Myofilamenten aus Myosin und Aktin.
Das Muskelwachstum während der frühen Embryonalentwicklung beginnt mit der begrenzten Vermehrung (Proliferation) von Myoblasten, den Vorläuferzellen der Skelettmuskelfasern [14]. Anschließend verschmelzen bis zu 100 Myoblasten miteinander und entwickeln sich in eine Muskelfaser [16]. Die Entwicklung einer Vorläuferzelle in einen anderen, spezialisierten Zelltyp wird Zelldifferenzierung genannt [17]. Das Interessante: während Myoblasten nur einen Zellkern enthalten, besitzt die Muskelfaser durch die Verschmelzung mehrerer Myoblasten mehrere Zellkerne, ist aber nur eine einzige Zelle. Im erwachsenen Muskelgewebe übernehmen die Satellitenzellen die Rolle als Muskelstammzellen. Nach Verletzungen und Verlust von Muskelzellen differenzieren sie in Myoblasten und bilden anschließend neue Muskelfasern. [18]. Die Differenzierung von Satellitenzellen in Muskelfasern funktioniert auch in der Zellkultur [19]. Satellitenzellen wurden bereits aus dem Skelettmuskelgewebe von Rindern, Hühnern, Lämmern, Schweinen, Truthähnen und Fischen isoliert [20-25]. Für die 2013 präsentierte Hamburger-Bulette wurden Rindersatellitenzellen verwendet [10] und ihr Wachstum in Bioreaktoren für die Produktion von In-vitro-Fleisch in großem Maßstab wurde kürzlich getestet [26]. Rindersatellitenzellen können aus Rinderkadavern oder Föten entnommen werden oder sie werden durch die Entnahme von Muskelgewebe (Biopsie) isoliert [27]. Im Normalfall wird Muskelgewebe entnommen, wofür das entsprechende Tier örtlich betäubt wird [28, 29].
Anschließend wird das Muskelgewebe zerkleinert und mit verschiedenen Enzymen (z.B. Trypsin) verdaut. In der Zellkultur werden dann die Rindersatellitenzellen von den anderen Zelltypen der Muskelgewebeprobe isoliert und angereichert [27]. Die Kultivierung von Skelettmuskelzellen aus Satellitenzellen kann in zwei Phasen mit unterschiedlichen Zielen eingeteilt werden: die Proliferationsphase und die Differenzierungsphase [30]. In der Proliferationsphase besteht das Ziel darin, aus den kultivierten Satellitenzellen die maximale Anzahl an Zellen zu erhalten, also die Anzahl der Zellteilungen und somit Verdopplungen zu erhöhen. Theoretisch herrscht bei der Zellproliferation ein exponentielles Verhältnis zwischen der Anzahl der Verdopplungen und der Anzahl der Zellen. Aus einer Zelle werden zwei, aus zwei nach der nächsten Zellteilung vier, dann acht, 16, 32 und so weiter. Obwohl Satellitenzellen die Stammzellen des Muskelgewebes sind, können sie sich nicht unendlich oft teilen. Abhängig vom Alter der Zellen, teilen sich Satellitenzellen etwa 20-mal und stellen die Zellteilung anschließend ein [19]. Die maximale Anzahl an Zellteilungen von Satellitenzellen in der Zellkultur unter den richtigen Bedingungen von 20 auf 30 zu erhöhen hätte bereits enorme Auswirkungen, da dies die Ausbeute bzw. Zellzahl um das Tausendfache aufstockt [30]. Aus diesem Grund müssen die Zellen möglichst lange in einem teilungsfähigen Zustand gehalten und eine vorzeitige Differenzierung in teilungsunfähige Muskelfasern verhindert werden. Dies kann durch die Zugabe bestimmter Wachstumsfaktoren in das Zellkulturmedium erreicht werden. Für die Proliferation von Skelettmuskelzellen sorgen vor allem Fibroblasten-Wachstumsfaktoren und zu einem geringeren Anteil der Wachstumsfaktor Insulin-like growth factor 1 [31].
Nachdem genügend Zellen produziert wurden, besteht der nächste Schritt darin, die Satellitenzellen zu Skelettmuskelzellen zu differenzieren. Die Differenzierung von Skelettmuskelzellen wird maßgeblich von Insulin-like growth factor 1 gesteuert [31]. Insgesamt können durch unterschiedliche Konzentrationen der drei Wachstumsfaktoren Transforming Growth Factor β, Fibroblasten-Wachstumsfaktor und Insulin-like growth factor 1 Proliferation und Differenzierung von Satellitenzellen gesteuert werden [31]. Der einfachste Weg, die Differenzierung von Satellitenzellen in Skelettmuskelfasern einzuleiten, ist die Entfernung von Wachstumsfaktoren aus dem Medium [26, 29]. Bei Satellitenzellen geschieht die Differenzierung dann fast auf natürliche Weise. Die Zellen verschmelzen miteinander, bilden Vorläufer von Muskelfasern und beginnen, die für Muskelfasern typische Proteine wie MyoD, Myogenin und embryonale Isoformen der schweren Muskelmyosinkette zu bilden [30]. Zusammen mit der Differenzierung werden die Satellitenzellen gleichzeitig zu einer größtmöglichen Proteinproduktion (Hypertrophie) angeregt [30]. Unter Hypertrophie versteht man die Größenzunahme eines Gewebes durch die Vergrößerung der einzelnen Zellen. Damit die Zellen hypertroph werden, sind neben biochemischen und metabolischen auch mechanische Reize nötig [30], die sowohl über das Zellkulturmedium gesteuert, als auch über bestimmte Zellgerüste und Mikroträger ausgelöst werden können, auf die ich in Teil 3 tiefer eingehe.
Im Grunde ist jedoch an dieser Stelle der Prozess von Muskelstammzelle zu im Labor gewachsenem Muskelgewebe abgeschlossen. Der Ablauf lautet zusammengefasst also wie folgt: 1) Entnahme von Muskelgewebe aus einem Tier und Isolation der Muskelstammzellen (Satellitenzellen) für die anschließende Zellkultur; 2) Kultivierung der Satellitenzellen unter Bedingungen, die zu möglichst vielen Zellteilungen führen, um die maximale Anzahl an Zellen zu erhalten; 3) Einleiten der Zelldifferenzierung, sodass sich die Satellitenzellen zu Muskelfasern entwickeln, und das gleichzeitige Auslösen der Hypertrophie, damit die Zellen an Größe zunehmen. Die Schritte zwei und drei können über die Konzentrationen verschiedener Wachstumsfaktoren im Zellkulturmedium gesteuert werden. Als nächstes können die Muskelzellen geerntet und zu einem fleisch-ähnlichen Produkt verarbeitet werden.
Neben Satellitenzellen können auch andere Stammzellen als Ausgangspunkt für die Herstellung von In-vitro-Fleisch genutzt werden. Satellitenzellen sind unipotente Stammzellen; das heißt, sie können sich ausschließlich in Myoblasten differenzieren und so zerstörtes Muskelgewebe ersetzen. Um dem Geschmack und der Konsistenz konventionellen Fleischs näher zu kommen, wird überlegt, die im Labor erzeugten Muskelzellen mit Zellen des Fett- und Bindegewebes zu vermischen, um auf diese Weise die Zusammensetzung eines richtigen Muskels nachzuahmen [30]. Die Eingeschränktheit der Satellitenzellen sich ausschließlich in Muskelzellen differenzierten zu können, sowie ihre begrenzte Anzahl an Zellteilungen ist somit nicht optimal. Aus diesem Grund kämen auch embryonale Stammzellen zur Herstellung von In-vitro-Fleisch in Frage [28]. Im Gegensatz zu den unipotenten Satellitenzellen, die sich ausschließlich in Myoblasten entwickeln können, sind embryonale Stammzellen pluripotent.
Pluripotente Zellen können sich in jeglichen Zelltyp eines Organismus differenzieren und somit verschiedene Zellen, Gewebe und Organe bilden. Im Embryo bilden embryonale Stammzellen die Vorläufer sämtlicher Körperzellen und können sich prinzipiell unendlich oft teilen [32]. Sie haben somit den großen Vorteil, über lange Zeit als undifferenzierte Stammzellen kultiviert werden zu können, sodass ihre Differenzierung in Myoblasten erst bei Erreichen der benötigten Zellzahl ausgelöst werden kann. Zusätzlich könnten die embryonalen Stammzellen nicht nur in Muskelzellen, sondern auch in Bindegewebs- und Fettzellen differenziert werden. Embryonale Stammzellen hören sich somit nicht nur für die medizinische Forschung sehr vorteilhaft an, sondern auch für die Herstellung von In-vitro-Fleisch. Embryonale Stammzellen haben jedoch einen entscheidenden Haken: für ihre Gewinnung müssen Embryonen zerstört werden. Aus diesem Grund ist ihre Verwendung in der medizinischen Forschung auch höchst umstritten [33]. Hinzu kommt, dass bisher für kaum eine Tierart die Kultivierung embryonaler Stammzellen vorgenommen wurde; lediglich embryonale Stammzellen von Menschen, Mäusen und Affen wurden bislang kultiviert [34-36].
Kürzlich ist es gelungen die Kultur embryonaler Stammzellen von Rindern zu etablieren [37]. Die Gewinnung pluripotenter Stammzellen kann jedoch auch ohne die Zerstörung eines Embryos von statten gehen. Dies ist möglich, indem induzierte pluripotente Stammzellen (iPSC) genutzt werden. iPSCs wurden erstmals 2006 im Labor des japanischen Wissenschaftlers Shinya Yamanaka erzeugt, indem Bindegewebszellen von Mäusen umprogrammiert wurden [38]. Ein Jahr später gelang dies der gleichen Arbeitsgruppe auch mit menschlichen Bindegewebszellen [39]. Wie der Name es bereits vorhersagt, sind iPSCs pluripotent. Sie können sich also wie embryonale Stammzellen in jeden Zelltyp eines Organismus differenzieren. Das macht die Zellen für die medizinische Forschung besonders interessant. Der große Vorteil von iPSCs: sie können aus bereits ausdifferenzierten Zellen eines Organismus erzeugt werden, sodass im Vergleich zur Gewinnung embryonaler Stammzellen keine Embryonen zerstört werden müssen. Für die Umprogrammierung einer Körperzelle in eine pluripotente Stammzelle reicht die Ausbildung der vier Proteine Oct4, Sox2, cMyc und Klf4 in der Zelle aus [38]. Es würde sich also anbieten für die Herstellung von In-vitro-Fleisch teilungsaktive, pluripotente Stammzellen zu verwenden, die anschließend in Myoblasten differenziert werden. Dies könnte nicht nur die Zellausbeute vergrößern, sondern es auch ermöglichen, die gleichen Stammzellen desselben Tieres in weitere Zelltypen zu differenzieren. So könnten auch Zellen des Fett- und Bindegewebes erzeugt werden, die den Muskelfasern beigemischt werden, um Geschmack und Konsistenz des In-vitro-Fleischprodukts zu verbessern und es qualitativ konventionellem Fleisch noch weiter anzunähern.
Die Nutzung solcher Stammzellen würde die Notwendigkeit weitere Tierzellen isolieren zu müssen beseitigen.
Die Potenz verschiedener Stammzellen und ihre Stammzelllinien
Im Laufe der Embryonalentwicklung wird das Potenzial von Stammzellen, andere Zelltypen auszubilden, immer weiter eingeschränkt. Je weiter eine Stammzelle entwickelt ist und je mehr sie eine bestimmte Abstammungslinie einschlägt, desto geringer ist ihr Potenzial, verschiedene Arten von Zellen hervorzubringen. Lediglich die befruchtete Eizelle ist totipotent und besitzt die Fähigkeit, einen vollständigen bzw. eigenständigen Organismus zu bilden. Bei der weiteren Entwicklung von Eizelle über Morula zu Blastozyste verlieren die Zellen ihre Totipotenz und sind fortan pluripotent. Pluripotente Stammzellen können sich zu Zellen der drei Keimblätter (Ektoderm, Mesoderm, Endoderm) und zu Zellen der Keimbahn (Eizellen und Spermien) eines Organismus entwickeln. Im Gegensatz dazu, können sich multipotente Stammzellen meist nur noch in Zellen eines der drei Keimblätter entwickeln. Oligopotente Zellen können sich in verschiedene Zelltypen innerhalb eines Gewebetyps differenzieren, während unipotente Zellen ausschließlich Zellen desselben Typs bilden können. Am Ende der Differenzierung entstehen ausdifferenzierte Zellen. Einige, ausdifferenzierte Zellen können durch die Bildung der vier Proteine Oct4, Sox2, cMyc und Kfl4 zu induzierten, pluripotenten Stammzellen (iPSCs) umprogrammiert werden, die nahezu identische pluripotente Eigenschaften besitzen wie embryonale Stammzellen. (Abbildung entlehnt von [40])
Welche Zelltypen werden in Patentanmeldungen genannt?
Die wenigsten Patentanmeldungen der In-vitro-Fleisch Unternehmen machen spezifische Angaben zu den verwendeten Zelltypen. Stattdessen werden oft sehr allgemeine Patentansprüche formuliert, die eine Vielzahl möglicher Zelltypen von unterschiedlichen Tierarten einschließen. In einigen der einsehbaren Patentanmeldungen des in New Jersey angesiedelten Unternehmens Modern Meadow werden Ansprüche der beschriebenen Verfahren beispielsweise auf alle „nicht-menschlichen“ Myoblasten erhoben [41] oder es wird ganz allgemein über „Zellen“ geschrieben [42]. Memphis Meats, über deren Patentanmeldungen ich später noch detaillierter schreiben werde, erhebt in einigen Patentanmeldungen ganz allgemein Ansprüche auf Verfahren, bei denen „eine sich selbst erneuernde Zelllinie tierischen Ursprungs“ [43] oder eine „Körperzelle vielzelliger Tiere“ [44] verwendet wird.
Die einzige bislang einsehbare Patentanmeldung der Firma Wild Type, die die gesamte Technologieplattform der Firma beschreibt, zählt viele der möglichen Zelltypen auf, die zur Herstellung von Fisch auf Zellbasis verwendet werden können, sowie den Prozess der Umwandlung jedes Zelltyps in reife Muskel- und Fettzellen [45]. Darunter befinden sich sowohl embryonale Stammzellen und IPSCs, als auch Bindegewebszellen oder Vorläuferzellen von Muskel- und Fettzellen. Das israelische Start-Up-Unternehmen Future Meat Technologies beschreibt einen etwas anderen Weg zur Erzeugung von Muskelzellen für die Herstellung von In-vitro-Fleisch. Als Ausgangszellen dienen Bindegewebszellen von Hühnern, die aus befruchteten Hühnereiern isoliert wurden. Diese Zellen altern normalerweise über die Zeit und hören irgendwann auf, sich zu teilen. Um dieses Problem zu umgehen, wartet Future Meat auf natürliche Mutationen in den Zellen, die unsterbliche, also sich unendlich oft teilende, Zellen hervorrufen [46]. Dieses Vorgehen basiert auf einem eigenen, mittlerweile abgelaufenen Patent [47].
Unsterbliche Zellen, die aus spontanen Mutationen hervorgehen, klingen auf den ersten Blick ungewöhnlich. Im Grunde passiert dies aber zum Beispiel auch bei Krebszellen, die sich aufgrund von Genmutationen unkontrolliert vermehren. Die Nutzung von Bindegewebszellen hat gegenüber anderen Zelltypen einige Vorteile. Zum einen gibt es für diese Zelllinie bereits Zellkulturmedien, die ohne tierisches Serum auskommen. Zum anderen besitzen Bindegewebszellen eine schnelle Verdopplungszeit. Darüber hinaus beschreibt Future Meats in der Patentanmeldung ein Suchverfahren nach kleinen Molekülen, die die Zelldifferenzierung der Bindegewebszellen in Muskel- oder Fettzellen auslösen [46].
Aus den einsehbaren Patentanmeldungen geht somit hervor, dass es nicht den einen Zelltyp gibt, den alle Firmen zur Herstellung von In-vitro-Fleisch nutzen. Vielmehr scheint es so, als sei das allgemeine Verfahren, wie aus einer Stammzelle oder Muskelstammzelle im Labor kultiviertes Muskelgewebe wird, klar und läuft im Allgemeinen so ab, wie oben beschrieben. Im Einzelnen testet jedoch jede Firma ihre eigene Methode und vergleicht vermutlich bei der Herstellung von In-vitro-Fleisch unterschiedliche Zelltypen miteinander, um sich später auf die am besten funktionierende festzulegen.
Die alleinige Nutzung von Tierzellen zur Erzeugung von In-vitro-Fleischprodukten ist allerdings noch längst nicht alles.
Einen interessanten und einzigartigen Ansatz verfolgt das israelische Unternehmen SuperMeat. In der Patentanmeldung „Kultiviertes fleischhaltiges Hybrid-Nahrungsmittel“ wird die Herstellung eines Nahrungsmittels beschrieben, dass sowohl aus Pflanzen- als auch aus Tierzellen besteht [48]. Der Masseanteil kultivierter Tierzellen am Endprodukt beschränkt sich auf maximal 30% und soll Geschmack, Aussehen, Struktur und Empfindung verbessern. Fleischprodukte auf pflanzlicher Basis sind zurzeit noch günstiger als Nahrungsmittel tierischer Zellkultur, sodass Mischprodukte bereits gewinnbringend verkauft werden könnten, bevor der Preis für tierzellbasiertes Fleisch niedrig genug ist, um mit konventionellen Produkten zu konkurrieren.
Besonders spannend ist ein Geschmackstest, der innerhalb der Patentanmeldung präsentiert wird, und bei dem verschiedene Mischprodukte (Wurst, Rinderhackfleisch, Schnitzel) mit variierendem Anteil kultivierter Leberzellen bewertet wurden. Geringe Mengen kultivierter Leberzellen in den Mischprodukten schienen deren Geschmack deutlich zu verbessern. Während jedoch bei zellbasiertem Rinderhackfleisch die Bewertung des Geschmacks mit zunehmender Menge an Tierzellen stetig zunahm (bis zu einem Gesamtanteil von 27%), steigerte die Zugabe von Leberzellen zu zellbasierter Wurst die geschmackliche Bewertung lediglich bis zu einem Anteil von 13%, jedoch nicht darüber hinaus. Bei zellbasiertem Schnitzel war es sogar so, dass Leberzellmengen von 13 bis 20% am besten bewertet wurden, eine höhere Menge an Leberzellen am Mischprodukt geschmacklich jedoch schlechter abschnitt [48].
Werden die Zellen gentechnisch verändert?
Um es kurz zu beantworten: Nein. Die Herstellung von In-vitro-Fleisch kommt ohne gentechnische Veränderungen aus. Auch in den meisten Patentanmeldungen wird an den Zellen keine gentechnische Veränderung vorgenommen. Trotzdem gibt es ein paar mögliche Ausnahmen. Dies betrifft die Nutzung von induzierten pluripotenten Stammzellen. Wie bereits oben beschrieben, können adulte, ausdifferenzierte Zellen in pluripotente Stammzellen umprogrammiert werden, indem gerade einmal vier Proteine in diesen Zellen ausgebildet werden [38]. In der ursprünglichen Studie von Shinya Yamanaka wurden die Gene, die für diese vier Proteine kodieren, fest in das Genom der Zelle eingebracht [38]. Bei den auf diese Weise erzeugten Stammzellen handelt es sich somit um gentechnisch veränderte Zellen, auch wenn die eingesetzten Gene aus der gleichen Spezies stammen. Mittlerweile gibt es mehrere Methoden, die ohne den Einbau der vier Gene in das Zellgenom auskommen, und stattdessen vorübergehend einzelsträngige RNA mit den Informationen zur Bildung der vier nötigen Proteine in die Zelle einschleusen [49, 50]. Bei induzierten pluripotenten Stammzellen, die auf diese Weise erzeugt worden sind, handelt es sich nicht um gentechnisch veränderte Zellen.
In den einsehbaren Patentanmeldungen der In-vitro-Fleisch Unternehmen finden sich keine gentechnischen Verfahren, die das Erbgut der verwendeten Zellen verändern. Einzige Ausnahme ist die Firma Memphis Meats aus San Francisco. Vier Patentanmeldungen von Memphis Meats sind zurzeit (Oktober 2020) öffentlich zugänglich und bei allen vier werden die verwendeten Zellen gentechnisch verändert, um deren Wachstumsrate zu erhöhen. Die in den Patentanmeldungen beschriebenen Verfahren bieten eine ziemlich gute Einsicht in die Probleme, die mit der Herstellung von In-vitro-Fleisch in hohem Maßstab einhergehen. In einem 2014 angemeldeten Patent beschreibt Memphis Meats beispielsweise eine gentechnische Veränderung von Stammzellen zur Kontrolle zwischen Zellproliferation und Zelldifferenzierung [43]. Dafür wird in das Genom der Zellen ein „double-switch“ Mechanismus eingebracht. Durch Zugabe des Moleküls Doxycyclin in das Zellkulturmedium werden zwei Gene für die Zellproliferation angeschaltet und die Stammzellen vermehren sich. Entfernt man Doxycyclin aus dem Medium und fügt stattdessen das Molekül 17-β-Estradiol hinzu, aktiviert das ein Gen für die Zelldifferenzierung [51, 52]. Auf diese Weise kann über das Zellkulturmedium gezielt die Proliferation oder Differenzierung in Muskelzellen gesteuert werden.
In einer weiteren Patentanmeldung beschreibt Memphis Meats zwei Verfahren, um Muskelzellen unsterblich zu machen, also eine unbegrenzte Vermehrung der Zellen zu ermöglichen [44]. Zum einen soll das Gen für das Protein Telomerase Reverse Transkriptase (TERT) zusätzlich in das Genom der Zellen eingebracht werden, wodurch mehr von diesem Protein gebildet wird. Es ist bereits seit vielen Jahren bekannt, dass die vermehrte Bildung von TERT Zellen zur Unsterblichkeit verhilft, weswegen TERT auch in manchen Krebszellen in erhöhten Mengen gebildet wird [53]. Eine weitere Variante, die von Memphis Meats beschrieben wird, um unsterbliche Zellen zu erzeugen, ist der Knockout zweier Gene mittels der Genschere CRISPR-Cas9. Es handelt sich dabei um die beiden Gene für die Tumorsuppressoren p15 und p16, deren Ausfall Zellen unsterblich macht [54].
Eine dritte Patentanmeldung von Memphis Meats aus dem Jahr 2018 führt gentechnische Veränderungen auf, um den Hippo-Signalweg zu blockieren [55]. Der Hippo-Signalweg steuert während der Entwicklung die Organgröße, indem er die „Kontakthemmung“ von Zellen reguliert, also die Tendenz von Zellen, die Teilung zu stoppen, wenn sie mit anderen Zellen in Kontakt kommen [56]. Während der Organentwicklung wird dieser Signalweg in den Zellen aktiv, wenn das Organ wächst und die Zelldichte zunimmt, sodass die Organgröße reguliert wird. Ein Ausschalten des Hippo-Signalwegs führt dazu, dass Zellen in Zellkultur trotz hoher Dichte weiter proliferieren können, was in einem effizienteren Kultivierungsprozess und somit günstigerem In-vitro-Fleisch-Endprodukt resultiert. Die Hemmung des Hippo-Signalwegs verändert das Zellverhalten also auf eine Weise, die nützlich ist, um Kosten für Zellkultur in großem Maßstab zu senken. Neben der erhöhten Zelldichte, zeigt Memphis Meats in der Patentanmeldung auch, dass die Hemmung des Hippo-Signalwegs die Fähigkeit der Zellen erhöht sich ohne fetales Kälberserum (FCS; siehe Teil 1) zu vermehren. Zusätzlich zeigen die verwendeten Muskelstammzellen eine verminderte Neigung, sich in reife Muskelzellen zu differenzieren. Die Patentanmeldung umfasst verschiedene gentechnische Modifikationen sowie die Zugabe verschiedener Moleküle in das Zellkulturmedium, um den Hippo-Signalweg zu hemmen [55].
Die vierte Patentanmeldung von Memphis Meats diskutiert eine Reihe gentechnischer Veränderungen an Muskelstammzellen, die für die Zellproduktion in großem Maßstab von Vorteil sind [57]. Neben Modifikationen, die bereits in anderen Patentanmeldungen aufgeführt sind, wir die erhöhte Ausbildung des Enzyms Glutamin-Synthetase als vorteilhafte gentechnische Veränderung beschrieben. Glutamin-Synthetase wandelt Ammoniak in die Aminosäure Glutamin um. Ammoniak entsteht auf natürliche Weise während der Zellatmung und kann in hohen Konzentrationen toxisch auf die Zellen wirken. Im Körper wird Ammoniak über den Blutstrom gefiltert und im Urin entsorgt oder als Quelle für Stickstoff wiederverwendet. Diese Mechanismen stehen in groß angelegten Zellkulturen jedoch nicht zur Verfügung. Indem Glutamin-Synthetase einen Teil des überschüssigen Ammoniaks aufnimmt und in Glutamin umwandelt, steht Glutamin den Zellen als wichtige Aminosäure und alternative Energiequelle zur Verfügung. Durch die vermehrte Ausbildung von Glutamin-Synthetase kann der Ammoniakspiegel kontrolliert und gleichzeitig der Gehalt einer Aminosäure erhöht werden, die in anderen Proteinen wiederverwendet werden kann. Zusätzlich wird Glutamin dadurch eventuell nicht mehr oder in geringeren Konzentrationen im Zellkulturmedium benötigt, was die Kosten des Zellkulturmediums senkt und Kontamination durch von außen hinzugefügtem Glutamin verringert.
Alle vier von Memphis Meats einsehbare Patentanmeldungen erläutern somit Methoden, um Stammzellen bzw. Muskelstammzellen gentechnisch zu verändern, wodurch auch das In-vitro-Fleischprodukt als gentechnisch verändert gekennzeichnet werden müsste. Da die Patentanmeldungen anderer In-vitro-Fleisch Unternehmen ohne gentechnische Veränderungen ihrer Zelllinien auskommen, scheinen solche Modifikationen prinzipiell nicht notwendig zu sein. Dennoch geben die angemeldeten Verfahren von Memphis Meats eine gute Einsicht in die Probleme, die mit der In-vitro-Fleischproduktion im hohen Maßstab einhergehen.
Aus diesem Artikel sollte hervorgegangen sein, wie das Verfahren zur Erzeugung von Muskelgewebe im Labor bzw. in einer Zellkultur im Prinzip funktioniert. Darüber hinaus sollte aber auch deutlich geworden sein, dass die verschiedenen In-vitro-Fleisch Unternehmen unterschiedliche Ansätze verfolgen, um von einer pluripotenten Stammzelle oder einer unipotenten Muskelstammzelle zum erntefertigen Muskel zu gelangen. Die einsehbaren Patentanmeldungen spiegeln den Stand von Anfang 2019 wider und die Forschung rund um In-vitro-Fleisch wandelt sich schnell. Es bleibt abzuwarten, welche Zelllinien und Verfahren sich als geeignet für die Massenproduktion von In-vitro-Fleisch herausstellen. In Teil 3 gehe ich näher auf Mikroträger, Stützstrukturen und Bioreaktoren ein und diskutiere mögliche Umweltvorteile von In-vitro-Fleisch.
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