Mit Gentechnik gegen Malaria

Insektenbekämpfung mittels Genome Editing und Gene Drive

Stechmücken gehören für uns nicht gerade zu den beliebtesten Fluginsekten. Vermutlich würden sie sich auf einer Beliebtheitsskala zusammen mit Wespen um den letzten Platz streiten. Das perfide an Mücken ist, dass man sie tagsüber kaum wahrnimmt – solange zumindest, bis unsere Haut rund um einen Mückenstich anfängt zu jucken. Nachts nehmen wir Mücken dann sehr wohl wahr, wenn sie stechbereit, mit lautem Gesumme an unseren Ohren vorbeischwirren. Obwohl uns eine Mücke im Schlafzimmer den Schlaf rauben kann, geht von den allermeisten Mücken und deren Stichen keine Gefahr für uns aus. In anderen Regionen der Welt ist die Lage jedoch eine andere.

Viele Stechmücken übertragen beim Einstich in die menschliche Haut Krankheiten [3]. Die häufigste von Mücken übertragene Krankheit ist Malaria, an der über 400.000 Menschen pro Jahr sterben [1]. Aber auch Dengue, West-Nil-Fieber oder Zikafieber gehören zu den von Stechmücken auf den Menschen übertragenen Krankheiten. Jährlich stecken sich weltweit fast 700 Millionen Menschen an einer von Mücken übertragenen Krankheit an und über eine Millionen Menschen sterben an den Folgen dieser Erkrankungen [3]. Die Stechmücken spielen hierbei die Rolle des Überträgers, indem sie beim Einstich den eigentlichen Verursacher der Krankheit, also Parasiten, Bakterien oder Viren, in den Menschen befördern. Immer mehr Erreger entwickeln Resistenzen gegen Medikamente solcher Krankheiten oder die Überträger werden gegen die eingesetzten Insektizide resistent [2, 4, 5]. Hinzu kommt, dass die globalisierte Menschheit die Ausbreitung der Stechmücken und den von ihnen übertragenen Krankheiten beschleunigt, und dass der von der globalen Erwärmung verursachte Temperaturanstieg den Erregern sowie den Überträgern solcher Krankheiten ein Überleben in neuen Klimazonen ermöglicht [6, 7].

Neben den krankheitsübertragenden Stechmücken sind etliche weitere Insektenarten bekannt, die als Schadinsekten in der Landwirtschaft auftreten und dem Menschen somit indirekt schaden [8]. Die Eindämmung von Stechmücken und anderer Schadinsekten, geschieht meist über den Einsatz von Insektiziden. In der Vergangenheit konnten durch das massive Sprühen von Insektiziden mückenübertragene Krankheiten stark eingeschränkt und in einigen wenigen Gebieten sogar die Malaria ausgerottet werden [4, 9]. Die Wirksamkeit von Insektiziden ist jedoch häufig zeitlich begrenzt. Bereits in den 1950er Jahren wurde erstmals über Mückenresistenzen gegen Insektizide auf Basis von Chlorkohlenwasserstoffen berichtet [10]. Die weit verbreitete Entwicklung von Resistenzen bei Mücken gegen die am häufigsten verwendeten Insektizide führt heutzutage in vielen Gebieten zu ernsthaften Problemen und hat in den letzten Jahren eine Reihe von Ausbrüchen von mückenübertragenen Krankheiten ausgelöst [2, 4].

Seit vielen Jahrzehnten werden deshalb nicht nur die Mechanismen untersucht, die die Insektizidresistenzen in den Stechmücken steuern, sondern auch alternative Bekämpfungsmethoden erforscht. Schon in den 1930er Jahren wurde über genveränderte Insekten als Alternative zu Insektiziden nachgedacht [11-13]. Seitdem wurden mehr oder weniger erfolgreich einige krankheitsübertragene Stechmücken oder anderweitige Schadinsekten unter Kontrolle gebracht [13, 14]. Neue gentechnische Verfahren wie Genome Editing und Gene Drive könnten solche Verfahren verfeinern und eventuell sogar dazu genutzt werden, Krankheiten wie Malaria für immer zu beseitigen.

Die ersten Insekten, die auf solche Weise manipuliert und freigesetzt wurden, waren männliche Neuwelt-Schraubenwurmfliegen in den 1950er Jahren [18, 19]. Diese Schadinsekten sind gefürchtete Parasiten, die ihre Eier in Wunden und Schleimhäute von Tieren ablegen. Die schlüpfenden Larven fressen sich anschließend unter die Haut, was zu ernsthaften und teils sogar tödlichen Folgen für den Wirtsorganismus führt. Betroffen sind warmblütige Tiere, wodurch insbesondere Nutzvieh aber auch der Mensch selbst der Neuwelt-Schraubenwurmfliege zum Opfer fällt. Um bei den Neuwelt-Schraubenwurmfliegen eine Sterilität zu erzeugen, bestrahlten Knipling und seine Kollegen die sechs Tage alten Puppen der Insekten mit Röntgenstrahlung [13]. Die daraus hervorgegangenen erwachsenen Organismen schienen zunächst normal zu sein, wenn die bestrahlten Männchen jedoch mit unbehandelten Weibchen verpaart wurden, schlüpfte keines der Eier. Wurden unbestrahlte und bestrahlte Männchen zusammen mit unbestrahlten Weibchen in Käfigen gehalten, konkurrierten die bestrahlten Männchen etwa gleich stark mit den unbestrahlten Männchen. Das heißt, die Bestrahlung machte die Männchen zwar steril, beeinflusste ihr Verhalten im Konkurrenzkampf um die Weibchen jedoch nicht [13].

Erste Freilandversuche der Sterilen-Insekten-Technik bei Neuwelt-Schraubenwurmfliegen wurden im Jahr 1954 auf der Insel Curacao durchgeführt. Innerhalb von vier Monaten konnten die Schädlinge auf der Insel ausgerottet werden [19]. In den Jahren von 1958 bis 1960 erfolgte die Ausrottung der Neuwelt-Schraubenwurmfliege in den südlichen Bundesstaaten der USA. Mittlerweile wurden die Schadinsekten in ganz Nordamerika und fast ganz Zentralamerika ausgerottet mit Panama als südlichste Barriere gegen die Insekten [19, 20]. Um diese Barriere aufrecht zu erhalten, werden in Panama pro Woche bis zu 20 Millionen sterile Neuwelt-Schraubenwurmfliegen freigelassen [21]. Dazu werden die Insekten massenhaft in Fabriken gezüchtet und durch Bestrahlung sterilisiert. Die gezüchteten Insekten dürfen hierbei keine Behinderung für den Konkurrenzkampf mit den wilden, fruchtbaren Artgenossen erleiden.

Die Notwendigkeit, dauerhaft neue sterile Männchen in die Umwelt entlassen zu müssen, ist der größte Nachteil dieser Art von genetischer Insektenbekämpfung. Da die sterilen Insekten keine Nachkommen erzeugen, geben sie ihre Gene auch nicht an die nächste Generation weiter. Das bedeutet auch, dass sich die freigelassenen, sterilen Insekten nicht in der Umwelt etablieren. Langfristig kann sich die zwischenzeitlich reduzierte Population wieder erholen und die Bekämpfung durch den Menschen muss von vorne begonnen werden, indem erneut sterile Insekten freigesetzt werden.

Neben der Neuwelt-Schraubenwurmfliege wurden und werden auch andere Schadinsekten mit Hilfe der Sterilen-Insekten-Technik bekämpft. Die Mittelmeerfruchtfliege, ein Schädling im Obst- und Gemüseanbau, wurde in Teilen Mittel- und Südamerikas erfolgreich ausgerottet [22, 23]. In Kroatien und Spanien wird sie immer noch aktiv zurückgedrängt. In den Niederlanden wird die Zwiebelfliege in Zwiebelanbaugebieten unter Kontrolle gehalten [24]. Ihre Larven schädigen Zwiebel-, Knoblauch-, Schnittlauch-, Schalotten-, Lauch- und Blütenpflanzenzwiebeln. Immer wieder wurden auch Testversuche unternommen, um krankheitsübertragene Stechmücken unter Kontrolle zu bringen. In den 1970er Jahren wurden Malaria-übertragende Anopheles -Mücken in El Salvador nahezu ausgerottet [25, 26]. Im Jahr 1997 konnte beispielsweise die Tsetse-Fliege, Überträger der Schlafkrankheit, auf der Insel Sansibar ausgerottet werden [27]. In Australien wurden in den Jahren 2017 und 2018 über drei Millionen sterilisierte Männchen der Gelbfiebermücke freigelassen, woraufhin die Mückenpopulation um 80 Prozent zurückging [28]. Die Gelbfiebermücke überträgt vor allem Gelbfieber, Dengue und Zikafieber.

Die dauerhafte Freilassung immer neuer sterilisierter Insekten ist über die Zeit sehr kostenintensiv. Zudem können auch Fehler passieren, indem beispielsweise bestrahlte Männchen freigelassen werden, die sich später jedoch als fruchtbar erweisen und somit gar keinen negativen Effekt auf die Population ausüben. Andererseits ist es möglich, dass durch die Bestrahlung Männchen erzeugt werden, die zwar steril sind, aber zusätzlich auch schwächer im Konkurrenzkampf um die Weibchen abschneiden. Der Einsatz ionisierender Strahlung kann hunderte Gene verändern. Es ist sehr wahrscheinlich, dass auch Gene beschädigt werden, die die Leistung der bestrahlten Insekten vermindern. Ein weiterer fehleranfälliger Faktor ist die Freilassung ausschließlich männlicher Insekten. Die Aufteilung in männliche und weibliche Organismen erfolgt bei der Sterilen-Insekten-Technik meist per Hand. Wenn dort Fehler unterlaufen, werden auch Weibchen in die Umwelt freigelassen, die sich wiederum mit den Männchen paaren [29]. Das hilft bei der Insektenbekämpfung nicht weiter.

Aus all diesen Gründen wird an verbesserten Verfahren zur genetischen Bekämpfung gearbeitet.

Wie bei der Sterilen-Insekten-Technik, werden auch bei den gentechnisch veränderten Insekten der Firma Oxitec ausschließlich Männchen freigelassen. Bei Mücken hat das den Vorteil, dass männliche Stechmücken weder Menschen noch Tiere stechen und daher nicht in der Lage sind, ihre DNA, Viren oder andere Speichelbestandteile zu übertragen. Im Fall von Gelbfiebermücken werden die gezüchteten, gentechnisch veränderten Insekten im Puppenstadium nach Geschlecht sortiert. Die weiblichen Puppen und Larven werden zunächst für 12 Stunden bei -15°C eingefroren und dadurch getötet, anschließend werden die Kadaver verbrannt [31]. Ausschließlich die männlichen Mücken werden in die Natur freigelassen, wo sie mit den gentechnisch unveränderten Männchen um die Weibchen konkurrieren. Begattet eine männliche, gentechnisch veränderte Mücke ein Weibchen, legt das Weibchen Eier und es schlüpfen Larven. Das Männchen hat das tTAV-Gen an die Hälfte seiner Nachkommen vererbt. Da in der Natur jedoch keine ausreichenden Mengen an Tetracyclin vorkommen, wird in den Larven das tTAV-Gen abgelesen und das tödliche tTAV-Protein in großen Mengen gebildet, wodurch die jungen Insekten sterben [31-33]. Die Abhängigkeit von Tetracyclin ist also die entscheidende Eigenschaft, die die Eindämmung von Insektenpopulationen ermöglicht.

Dadurch, dass alle Nachkommen, die das tTAV-Gen tragen, absterben, wird das Gen nicht an weitere Nachkommen weitergegeben. Gentechnisch veränderte Insekten können sich also nicht in der Population ausbreiten [30, 35]. Die Firma Oxitec hat die RIDL-Methode deswegen mittlerweile weiterentwickelt, sodass das tTAV-Gen ausschließlich in weiblichen Tieren abgelesen wird [36]. Die freigelassenen, männlichen, gentechnisch veränderten Mücken geben das tTAV-Gen gleichmäßig an weibliche und männliche Nachkommen weiter. Weil das tTAV-Gen aber nur in weiblichen Tieren abgelesen und in das tTAV-Protein übersetzt wird, überleben alle männlichen Nachkommen. Diese männlichen Nachkommen können das tTAV-Gen ebenfalls an die nächste Generation weitergeben und so weiter. Das tTAV-Gen verbleibt somit länger in der Mückenpopulation und nimmt langsam mit der Zeit ab [36]. Auch hier sei also angemerkt, dass die gentechnische Veränderung nicht für immer in der Population bleibt. Alle weiblichen Tiere mit dem Genkonstrukt sterben schon im Larvenstadium und alle gentechnisch veränderten Männchen können das Gen nur an die Hälfte der Nachkommen weitergeben. Über die Zeit verdünnt sich der Anteil an Insekten mit dem künstlichen Genkonstrukt in der Population, bis es schließlich kein Tier mehr mit dem tTAV-Gen gibt. Ähnlich zur Sterile-Insekten-Technik dämmt also auch die RIDL-Methode die Insektenpopulation eventuell nur vorübergehend ein. Erholt sich die Population nach einiger Zeit, müssen erneut Bekämpfungsmaßnahmen vorgenommen werden bzw. erneut gentechnisch veränderte Insekten freigesetzt werden.

Ägyptische Tigermücken, die auf die oben beschriebene Weise gentechnisch verändert und von der Firma Oxitec gezüchtet und freigesetzt wurden, führten in den entsprechenden Gebieten in Brasilien zu einem Einbruch der Mückenpopulation um 80 Prozent [37, 38]. Im Jahr 2021 sind zudem Freisetzungen solcher Mücken in Florida und Texas geplant [30, 39]. Oxitec plant zusätzlich die Züchtung gentechnisch veränderter Anopheles -Mücken zur Eindämmung von Malaria [40].

Neben diesen krankheitsübertragenden Stechmücken arbeitet das Unternehmen Oxitec auch an gentechnisch veränderten Schädlingen, wie der Mittelmeerfruchtfliege, der Kirschessigfliege und verschiedenen Schmetterlings- und Mottenarten, deren Raupen immense Fraßschäden verursachen [40].

Um zu verstehen, wie Gene Drive mittels Genschere funktioniert, sind zunächst ein paar Hintergrundinformationen notwendig. Die erste Information betrifft das Genom von Organismen. Die meisten vielzelligen Tiere besitzen ihre Chromosomen in zweifacher Ausführung. Das wird am Beispiel des Menschen am deutlichsten: die allermeisten menschlichen Zellen enthalten 46 Chromosomen. Die Hälfte, also 23 Chromosomen, wurden von der Mutter vererbt, die andere Hälfte vom Vater. Zwei gleiche Chromosomen werden homologe Chromosomen genannt. Weil alle Chromosomen in der Zelle doppelt vorliegen, gibt es natürlich auch alle auf den Chromosomen liegenden Gene in doppelter Ausführung.

Was hat das alles mit Insektenbekämpfung und Malaria zu tun?

Das wird an folgendem Beispiel klar: Wissenschaftler*innen der Universität Kalifornien versuchen Stechmücken der Gattung Anopheles so gentechnisch zu verändern, dass sie einen Antikörper gegen den Malaria-Erreger bilden [48]. Dadurch wären die Insekten gegen den Erreger resistent und würden auch die Krankheit nicht mehr verbreiten. Nehmen wir an, die auf diese Weise veränderten Mücken tragen zwei Kopien des Antikörper-Gens, jeweils auf einem homologen Chromosom. Wird eine solche gentechnisch veränderte Mücke in die Umwelt entlassen, paart sie sich mit den unveränderten, freilebenden Mücken ohne das Antikörper-Gen. Die gentechnisch veränderte Mücke wird das Gen für den Malaria-Antikörper an all ihre Nachkommen weitergeben. Allerdings immer nur eine Kopie. Die Nachkommen mit nur einer Kopie des Antikörper-Gens wären vermutlich immer noch resistent gegen den Erreger, weil auch geringere Mengen Antikörper gegen den Erreger wirksam wären. Interessant wird es aber, wenn sich diese Nachkommen weiter vermehren. Da die Anzahl gentechnisch veränderter Mücken deutlich geringer sein wird, als die Anzahl freilebender, unveränderter Mücken, muss davon ausgegangen werden, dass sich die genetechnisch veränderte Mücke mit einer unveränderten Mücke paart. Dadurch, dass das Antikörper-Gen nur in einer der beiden Mücken vorliegt und das auch nur als eine einzige Kopie, wird das Gen nur an die Hälfte der gezeugten Nachkommen vererbt. Die andere Hälfte der Nachkommen erhält dieses Gen nicht. Paart sich die neue Generation erneut mit gentechnisch unveränderten Mücken, dann gibt es zur Hälfte eine Paarung zwischen gentechnisch veränderten Mücken mit einer Kopie des Antikörper-Gens und unveränderten Mücken und zwischen zwei unveränderten Mücken. Hier wird das Vorhandensein des Antikörper-Gens in der Population also weiter verdünnt. Das geht so lange weiter, bis quasi kein Individuum mit dem Antikörper-Gen mehr lebt.

Bei der Gene Drive Methode versucht man dieses Ausdünnen eines Gens innerhalb einer Population zu verhindern. Man geht sogar noch weiter: beim Gene Drive soll ein bestimmtes Gen dauerhaft an alle gezeugten Nachkommen vererbt werden. Und: alle Individuen sollen zwei Kopien dieses Gens besitzen [47].

Hier kommt eine weitere Hintergrundinformation ins Spiel. Diesmal zur Genschere CRISPR/Cas9 und den zellulären Reparaturprozessen nach einem Doppelstrangbruch. Bei der CRISPR/Cas9 Methode wird die Genschere Cas9 genutzt, um einen Doppelstrangbruch in der DNA zu erzeugen. Cas9 kann hierbei an jede beliebige Stelle der DNA angesetzt werden. Alles, was dazu nötig ist, ist eine zur Ziel-DNA passende RNA. Diese sogenannte guide RNA führt die Cas9 Schere zur Zielstelle auf der DNA und bindet mittels Basenpaarung an den passenden DNA-Abschnitt. Anschließend schneidet Cas9 den Doppelstrang der DNA und es entsteht ein Doppelstrangbruch [45]. Die Zelle nimmt den Doppelstrangbruch wahr und versucht diesen zu reparieren. Dafür gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten. Dier erste Möglichkeit ist der Prozess des Non-homologous end joining [45]. Dabei werden die voneinander getrennten Enden der geschnittenen DNA-Stränge einfach wieder miteinander verbunden. Dieser Reparaturprozess funktioniert zwar sehr schnell, dafür ist er aber auch sehr fehleranfällig. Oft gehen einzelne Basenpaare verloren oder andere Basenpaare werden in die DNA eingefügt, sodass die ursprüngliche DNA-Sequenz verändert wird [49]. Die entstandenen Mutationen führen meist dazu, dass das Gen, das die reparierte DNA-Sequenz enthält, nicht mehr richtig ablesbar ist. Die Zelle besitzt aber noch einen zweiten Reparaturmechanismus, nämlich den der homologen Rekombination [45]. Hierbei macht die Zelle sich das intakte homologe Chromosom zunutze. Entsteht in einem Chromosom ein DNA-Doppelstrangbruch, existiert in den Zellen noch das zweite, homologe Chromosom mit dem unbeschädigten Stück DNA. Die Zelle nimmt diese unbeschädigte Kopie nun als Vorlage, um den Doppelstrangbruch im beschädigten Chromosom fehlerfrei zu reparieren. Wichtig ist, dass die Zelle dabei lediglich die beiden Enden des zerschnittenen Doppelstrangs auf Kopien im Genom abgleicht. Man spricht von sogenannten Homologie-Armen. Das bedeutet, dass DNA-Sequenzen, die zwischen solchen Homologie-Armen liegen, einfach mit in den reparierten DNA-Strang übernommen werden [50, 51]. Und genau das macht sich die Gene Drive Methode zu Nutze [47].



Kommen wir nun zurück zu unserem Gen für den Malaria-Antikörper, das in einer Mückenpopulation mittels Gene Drive verbreitet werden soll. Als erstes wird im Labor ein Genkonstrukt hergestellt, das das Gen für den Antikörper, das Gen für die Genschere Cas9 sowie die Sequenz für eine guide RNA enthält. Zur guide RNA kommen wir gleich. Zunächst wird dieses Genkonstrukt in die DNA einer Mücke eingebaut. Dafür gibt es verschiedene Methoden, eine Methode wäre zum Beispiel über die CRISPR/Cas9-Methode. Das Genkonstrukt wird dabei an einer Stelle im Genom eingebaut, die sicherstellt, dass kein anderes Gen dadurch zerstört wird und von der man weiß, dass sie auch abgelesen wird. Jetzt zur guide RNA. Wo soll die eingebaute Genschere denn eigentlich schneiden? Die guide RNA wird so programmiert, dass sie die Genschere zu der Stelle führt, in der das Genkonstrukt eingebaut wurde – allerdings auf dem homologen Chromosom. Das eingebrachte Genkonstrukt befindet sich zurzeit nur auf einem Chromosom. Das bedeutet es existiert noch das zweite, homologe Chromosom ohne Genkonstrukt. Ist die guide RNA passend zu der DNA-Sequenz, in die das Genkonstrukt eingebaut wurde, kann sie nicht mehr an diese Sequenz in dem Chromosom mit eingebautem Genkonstrukt binden. Hier wurde die Sequenz schließlich verändert. Somit bindet die guide RNA ausschließlich an das unveränderte Chromosom und führt das Cas9 Enzym an die Stelle, an der im anderen Chromosom das Genkonstrukt eingebaut wurde. Das Resultat ist ein Schnitt durch das Cas9 Enzym und ein Doppelstrangbruch. Die Zelle repariert diesen Bruch nun durch Homologe Rekombination und nimmt sich das intakte Chromosom mit eingebautem Genkonstrukt zum Vorbild. Dadurch kopiert die Zelle das Genkonstrukt auf das gerade geschnittene Chromosom und die Mücke besitzt nun zwei Kopien des Genkonstrukts [47]. In beiden Chromosomen ist jetzt durch das eingefügte Genkonstrukt die zur guide RNA passende DNA-Sequenz zerstört, sodass die Genschere nicht erneut schneiden kann.

Die veränderte Mücke gibt anschließend jeweils eine Kopie des Genkonstrukts mit Antikörper-Gen, Cas9-Gen und guide RNA Sequenz an alle ihre Nachkommen weiter. Die Nachkommen besitzen zunächst nur eine Kopie des Genkonstrukts. Da sie jedoch ein intaktes, homologes Chromosom einer gentechnisch unveränderten Mücke vererbt bekommen haben, kann die guide RNA nun wieder binden, Cas9 schneidet das Chromosom und mittels homologer Rekombination wird erneut das Genkonstrukt auch auf das zunächst unveränderte Chromosom kopiert. Die Mücke trägt also erneut zwei Kopien des Genkonstrukts und gibt bei der nächsten Paarung wieder jeweils eine Kopie an alle ihre Nachkommen weiter. Das eingebrachte Gen für den Malaria-Antikörper wird sich somit dauerhaft in der Population ausbreiten und etablieren. Theoretisch werden dadurch sämtliche Mücken der Population verändert [46, 47].



Indem das Genkonstrukt in bestimmte Genabschnitte eingefügt wird, kann verhindert werden, dass Mücken, bei denen als Reparaturmechanismus Non-homologous end joining stattfindet, überhaupt überleben. Gene Drive kann grundsätzlich für die Verbreitung aller möglichen Gene genutzt werden. Es könnte auch das RIDL-Konstrukt der Firma Oxitec flächendeckend in alle Individuen eingebaut werden, sodass die gesamte Mückenpopulation stirbt. Aber Gene Drive beschränkt sich nicht nur auf Mücken. Da die Methode auf dem CRISPR/Cas9-Verfahren basiert, kann sie in nahezu allen Lebewesen angewendet werden. Für eine schnelle Ausbreitung des gewünschten Gens sollte es sich natürlich um Lebewesen mit kurzer Generationszeit handeln. Bisher wurden Gene Drive Systeme bereits in Hefe, Stechmücken, Taufliegen und Mäusen getestet [52-54].

Quellen

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